Mikroskop, çeşitli merceklerin kullanılması ve bu merceklerin düzenlenmesi ile objelerin
görüntülerinin büyütülmesine olanak veren ve biyolojik araştırmalarda sıklıkla kullanılan bir
alettir. Mikroskobun bir diğer önemli işlevi, objelerin büyütülmesini sağlarken, dereceli bir
şekilde büyütülen objelerin çözünürlüğünü veya netliğini de artırmaktadır. Dolayısıyla,
mikroskop objelerin büyütülmesi ve aynı anda dereceli bir şekilde objelerin çözünürlüğünü
artırmaktadır. Görüntü büyütülmesi ve çözünürlük eş zamanlı düşünülmesi gereken iki
olaydır.
Mikroskoplarda, çözünürlük ve görüntü büyütülmesi, ışık ve mikroskop lensleri ile
sağlanmaktadır. Lensler, kullanılan ışığı çeşitli amaçlar için yönlendirmemizi sağlamaktadır.
Görüntü büyütülmesi (magnification), sanıldığının aksine, çözünürlük ile bire bir ilişkili
değildir. Çözünürlük ile bağıntıyı aşağıdaki formül güzel bir şekilde özetlemektedir.
Sayısal açıklık (numerical aperture), kullanılan lensin ışık toplama kapasitesinin, sayısal
ifadesidir. Daha ayrıntılı bahsetmek gerekirse, N.A, belirli bir lensten yayılan ışığın açısının,
geometrik olarak hesaplanmasıdır. Kullanılan objektif lensleri, N.A özelliklerine göre
işaretlenmişlerdir. N.A ile çözünürlük arasında doğrusal orantı vardır. Bir başka deyişle, N.A
değer yüksek olan bir lensin, çözünürlüğü de yüksektir.
Kırılma indeksi (n) (refractive index), ışığın kırılmadan, ne kadar iletildiğini/yayıldığını
belirten sayısal bir ifadedir. Başka kelimelerle ifade etmek gerekirse, yayılan ışığın, kırılan
ışığa oranını belirtmektedir. Kırılma indeksini belirten n değeri, kullanılan lensin ışık toplama
kapasitesini ifade eder. Bir başka deyişle, n değeri ne kadar yüksekse, kullanılan lensin ışık
toplayabilme kapasitesi o kadar büyük demektir. Örnek vermek gerekirse, yağın kırılma
indeksi havaya göre daha büyüktür (yağ=1.5, hava = 1.0)
Görüntünün mikroskop ile görülebilmesi için, yüksek düzeyde kontrast gerekmektedir.
Kontrastın, ışık yoğunluğu ve ışığın lenslerden geçme açısı değiştirilerek, ayarlanması
mümkündür. Işığın aydınlatma merceğinden ( condensor) gelme açısı, mikroskopta bulunan
Işık kaynağının dalga boyu
Çözünürlük = 0.61 x
Sayısal açıklık/ayrılık (N.A) ve diyafram diye tabir edilen (phase rings) bölümü ile ayarlanmaktadır. Kontrastı ayarlamada
kullanılan bir başka yöntemde, aydınlatma kaynağının önüne konabilen filtrelerdir. Dahası,
incelenecek olan örneğin çeşitli kimyasallar ile boyanması ile de kontrastı güçlendirmek
mümkündür.
Mikroskop çeşitleri
Lensler, filtreler ve ışık kaynağı, detaylı bir şekilde incelenmek istenen görüntünün,
büyütülmesi ve çözünürlüğünün arttırılması için kullanılmaktadır. Đncelenmek istenen
materyale göre ve sorulan bilimsel sorunun niteliğine göre, kullanılacak olan mikroskop
seçilmelidir.
Aydınlık Saha Mikroskobu
Kullanım: Kanlı ve sabitlenmiş doku örneği, hücreler ve mikroorganizmalar
Avantajları: Kullanımı kolay
Nasıl çalışır: Aydınlık saha mikroskobu, standart ışık mikroskobudur. Maksimum
aydınlanmanın ulaşılması hedeflenmiştir (Koehler aydınlatması)
Görünüm: Beyaz arka plan üzerinde, gri veya koyu renk görüntü.
Ne zaman ihtiyaç duyulur: Prokaryot veya ökaryot organizma ile çalışılmak istendiğinde.
Gereksinim: 10X ve 40X objektif lensleri, 10X (oküler) göz merceği ve Işık kaynağı olan
herhangi bir ışık mikroskobu
Karanlık Saha Mikroskobu
Kullanım: Yansıtılmış ve kırılmış ışık ile boyanmamış ıslak örneklerdeki küçük yapıları
gözlemlememizi sağlar.
Avantajları: Düşük kontrastlı veya boyanmamış örnekleri gözlemlememizi sağlar
Nasıl çalışır: Đncelenmek istenen örnek, sadece gözlemlenmek istenen objelerin ışık
kırınımlarına müsaade edecek bir biçimde aydınlatılır. Bu sayede, arka plan görünmez.
Görünüm: Koyu renkli arka planda, aydınlanmış objeler olarak görülür
Gereksinim: Karanlık alan engelleyicisi olan bir ışık mikroskobu. Engelleyici, mikroskop
tablasının altında kalan kısımdaki yoğunlaştırıcının altına ki, filtre tutucusuna yerleştirilir. Faz-Kontrast Mikroskobu
Kullanım: Islak, boyanmamış ve lam- lamel arasına yerleştirilmemiş örnekleri, kontrast
yardımıyla gözlemlememizi sağlar
Avantajları: Sabitlemeye ve boyamaya ihtiyaç yoktur
Nasıl çalışır: Đki filtre eş zamanlı olarak kullanılır. Birinci filtre, çerçeveden gelen ışık
haricindeki ışıkları engeller, ikinci filtre ise birinci filtreden kaynaklanan ayna
görüntüsündeki, çerçeveden gelen ışığı engeller. Dolayısıyla, direk ışık engellenir ve direk
olmayan, kırılarak dağılan ışık örneğe ulaştırılır.
Görünüm: Koyu renk ve açık gri renk görüntüler
Gereksinim: Đki engelleyici filtre kullanılır. Bir tanesi yoğunlaştırıcının altına, diğeri objektif
düzeneğinin içine monte edilmiş olmalıdır
Nomarski Görüntülemesi (DIC)
Kullanım: Saydam olan ve hücre içindeki bölümleri gözlemlememizi sağlar.
Avantajları: Örneklerin sabitlenmesine ve boyanması gerekmemektedir, dolayısıyla canlı
doku örnekleri veya hücrelerin gözlemlenmesine olanak sağlar.
Nasıl çalışır: Örneğin içinden geçen ışık, faz değişimleri meydana getirir. Bu faz değişimleri
genlik farklarına dönüştürülür ve daha yüksek kontrast oluşturulmasına olanak verir.
Görünüm: Üç boyutlu görüntü.
Gereksinim: Özel olarak tasarlanmış objektif lensleri.
Flüoresans Mikroskobu
Kullanım: Mikro organizmaların veya hücrelerin bölümlerini incelemek ve işaretlemek için
kullanılır
Avantajları: Normal ışık ile gözlemlenmesi olanaksız olan, organ veya hücre bölümlerini
görmemizi sağlar
Nasıl çalışır: Örnekler, flüoresans molekülleri ile işaretlenir. Đşaretlenen bu moleküllerin
uyarılmasıyla, yayılan ışık, filtreler ile işlenerek, renk ve kontrasta dönüştürülür.
Görünüm: Koyu bir arka plan ve canlı renkler
Gereksinim: Özel objektif lensi, uyarılabilen ışık kaynağı, kullanılan flüoresans boyalarına
uygun optik lensler. Ter (Inverted) Mikroskop
Kullanım: Flasklardaki ve çukur kaplardaki (dish) canlı hücrelerin morfolojilerini ve
kaplardaki yapışmış hücre örneklerinin doğal hallerinde (in situ) boyanmış görüntülerinin
incelenmesi için kullanılır
Avantajları: Uzak çalışma mesafesi
Nasıl çalışır: Flaskların ve tabakların, yerleşimi için Yoğunlaştırıcı (condenser), objektifin
üzerinde bulunmaktadır.
Görünüm: Koyu ve açık renk gri görüntüler
Gereksinim: Inverted mikroskop Faz-kontrast yoğunlaştırıcı, faz-kontrast objektifleri. 40X
veya daha büyük objektif.
Konfokal (confocal) Mikroskop
Kullanım: Organellerin, hücre iskeleti elementlerinin ve makro moleküllerin, hücre içindeki
konumlarını belirlemek için kullanılır.
Avantajları: Sığ alan derinliği ile odak dışı parlamalar engellenir ve arka plan yoğunluğu
azaltılır.
Nasıl çalışır: Flüoresans boyalarıyla, işaretlenmiş moleküller, lazer tarafından taranır.
Taranan imgeler tekrardan işlemden geçirilerek, üç boyutlu görüntü elde edilir.
Görünüm: Çözünürlüğü arttırılmış, standart flüoresans görüntü
Ne zaman ihtiyaç duyulur: Arka planın karmaşık olduğu, konum belirleme çalışmaları (
örnek olarak, bakterinin veya proteinin hücre içindeki yerini tespit etmek için)
Gereksinim: Konfokal mikroskop ve bilgisayar
ELEKTRON MĐKROSKOPU
Elektron mikroskobu, aydınlatma kaynağı olarak, ışık yerine elektronları kullanmaktadır.
Elektronların dalga boyu 0.04 nm’dir, görünebilen ışığın dalga boyundan yaklaşık 10000 kez
daha küçüktür. Elektronların dalga boyu, görünür ışığın dalga boyundan daha kısa
olduğundan, elektron mikroskobunun olanak sağladığı büyütme oranı ve çözünürlük, standart
ışık mikroskoplarına oranla daha fazladır. Elektronlar kullanılarak erişilen görüntü
büyütmesinin temel mekanizması, ışık kullanılan mekanizmalara benzemektedir ancak
elektron mikroskobu için uygulanılan teknolojiksel yaklaşım farklıdır. Elektron
mikroskoplarında, elektronlar, elektron tabancasında üretilirler ve vakum tüpünde dolaştırılır
ve hızlandırılırlar. Elektron huzmesinin odaklanması için, cam lenslerin yerine elektro mıknatıslar kullanılmaktadır. Cam lensler sadece ilgili görüntünün büyütülmesi işlemi için
kullanılmaktadır.
Elektron mikroskobunun kullanılması ve görüntü işlemi için örneklerin hazırlanması, standart
mikroskoplar ile karşılaştırıldığında daha karmaşıktır. Bunun için elektron mikroskopları için
özel görevliler ve elektron mikroskobu için ayrı üniteler atanmıştır.
Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)
Kullanım: Hücre içindeki yapıları detaylı incelenmesini sağlar
Avantajları: Yüksek çözünürlük. Konumlama çalışmaları için immünolojik işaretleme
yöntemi ile birleştirilerek kullanılması mümkündür
Nasıl Çalışır: Tungsten kaynak elektronları üretir. Elektronlar vakumda hızlandırılarak,
elektro mıknatıslar ile sabitlenmiş, bölümlere ayrılmış ve boyanmış örnek üzerine
odaklanması sağlanır. Görüntünü, film üzerinde veya fosforlu ekran üzerinde yakalanır.
Görünüm: Çapraz kesit şeklindeki siyah ve beyaz görüntüler
Gereksinimler: Transmisyon elektron mikroskobu
Taramalı (scanning) Elektron Mikroskobu (SEM)
Kullanım: Hücre dışındaki bileşenleri ayrıntılı olarak incelememizi sağlar
Avantajları: Yüksek çözünürlük. (Çözünürlük TEM’e göre daha düşüktür)
Nasıl Çalışır: Örnek, odağı sabitlenmiş elektron huzmesi ile taranır. Örneğe çarpan elektron
geri yansır ve yansıyan elektronlar, mikroskop tarafından algılanır ve TV görüntüsü şeklinde
çevrilir.
Görünüm: Hücre dışının üç boyutlu görünümü.
Gereksinimler: Taramalı elektron mikroskobuMikroskop Kısımları
1. Alt kaide.
2. Aydınlatma kontrol kadranı. Işık yoğunluğunun kontrol edilmesini sağlar.
3. Kondansör. Mercek sistemidir, ışık kaynağından veya aynadan gelen ışınları örnek
üzerinde toplar, örneğin aydınlatılmasını sağlar. Kondansör, çözünürlüğü, kontrastı,
odak derinliğini ve aydınlığı etkiler.
4. Diyafram kontrol halkası. Örneğe gelen ışın huzmesinin çapını kontrol etmemize,
dolayısıyla dağılan ışığı kontrol etmemizi sağlar.
5. Kondansör hizalama vidası.
6. Göz merceği (oküler)
7. Alan diyaframı kontrol halkası. Aydınlanma alanını/menzilini sınırlar.
8. Aydınlanma kaynağı
9. Kaba ayar düğmesi (makrovida)
10. Đnce ayar düğmesi (mikrovida)
11. Göz mesafesi ayarlama konsolu
12. Objektif lensleri. Objektif lensin kuvveti, mikroskobun çözünürlüğünü belirler.
13. Güç düğmesi. Işık kaynağını açıp kapamamızı sağlar.14. Hareketli revolver
15. Sıkıştırma klipsleri
16. Nesne tablası
17. Y-aksisi kontrol düğmesi. Preparatı yukarı ve aşağı hareket ettirmemizi sağlar.
18. X-aksisi kontrol düğmesi. Preparatı sağa ve sola hareket ettirmemizi sağlar.
(http://egitek.meb.gov.tr/dersdesmer/son_deney/deneyler/deney01.htm)
Aydınlatma Çeşitleri: Halojen lamba (quartz ışığı), ışık yoğunluğu fazladır ve renk sıcaklığı
fazladır, dolayısıyla, halojen lamba beyaz ışık verir. Halojen lambalar mikroskoplarda sıklıkla
kullanılır ve en iyi aydınlatma kaynaklarından biridir. Tungsten lamba (akkor ışık), renk
sıcaklığı düşüktür ve ışık sarımtırak renktedir.
Objektif lensleri: Her objektif lensi, sahip olduğu N.A numarasına göre, çeşidine göre ve
büyütme kuvvetine göre işaretlenmiştir.
Örneklerin ölçümü: Mikroskop altında incelenen örneklerin büyüklüklerini, tahminsel
ölçebilmemiz için geliştirilmiş çeşitli mekanik yardımcılar vardır. Bu işlemler için kalibre
edilmiş lamlar kullanılmaktadır (hemositometre). Petroff Hausse haznesi her ne kadar sayım
işlemi için kullanılsa da, bu haznenin içerdiği karelere bölünmüş alan, boyut tahmini için
kullanılmaktadır. Göz merceğinin içine yerleştirilen, oküler mikro metreler, kendi içinde barındırdığı büyüklükleri bilinen çembersel şekiller ile de boyut tahmini yapılmasına olanak
sağlar.
Đmersiyon Yağının Kullanılması
Đmersiyon yağı, kullanıldığında lensleri ve lam ve lamel arasında sabitlenmiş örneği kaplar ve
camın sahip olduğu kırılma indisine ulaşılmasını sağlar. Đmersiyon yağının kullanım amacı
maksimum çözünürlüğe ulaşmak içindir. Maksimum çözünürlük için, imersiyon yağı
preparatın üstüne uygulanabildiği gibi, kondansör lensinin üzerine uygulanarak, lam-lamel
örneğinin altında da bulunabilir. Farklı amaçlar için, faklı çeşitlerde imersiyon yağları
bulunmaktadır.
Bazı biyolojik örneklerin boyutları;
Prokaryotik hücre (E.coli) = 0.4 x 2 µm
Maya ( S. Cerevisiae) = 1-4 µm
İnsan kırmızı kan hücresi = 7.2 µm
Doku kültüründeki ökaryot hücre = 10-100 µm
Hücre çekirdeği = 5-25 µm
Mitokondri = 1-10 µm
Lizozom ve peroksizom = 0.2-0.5 µm PROTOKOL
Đmersiyon Yağının Objektif Lensi Üzerinde Kullanılması
1. Mikroskop altında, daha detaylı incelenmek istenen bölge 40X objektif lensi ile
belirlenir. Belirlendikten sonra, preparatın yeri değiştirilmeden 40X’lik objektif yağın
bulaşmaması için değiştirilir.
2. Işık altında incelenmek istenen bölgeye, çok az miktarda (1 damla) imersiyon yağı
preparatın üzerine uygulanır.
3. Đmersiyon yağı objektif lensi preparatının üzerine getirilir ve ayarlanır
4. Kaba ayar ve ince ayar kullanılarak incelenmek istenen bölge bulunur.
5. Mikroskop ile inceleme işlemi tamamlandığında, imersiyon yağı temizlenir ( Bu işlem
için eter veya xylene kullanılabilir)
Kondansör Lensinin Üzerine Đmersiyon yağı Uygulanması
1. Nesne tablasının boş olmasına dikkat edilir. Eğer nesne tablasının üzerinde preparat
mevcut ise, preparat nesne tablasından uzaklaştırılır.
2. Kondansör lensinin üzerine bir damla imersiyon yağı uygulanır.
3. Preparatın alt tarafında kalan bölüme, incelenmek istenen alanın altına imersiyon yağı
uygulanır.
4. Kondansör yükseltilir ve kondansör lensinin üzerinde ki yağ damlası ile preparatın
altına uygulanan yağ damlasının birleşmesi sağlanır.
5. Đncelenmek istenen bölgenin üzerine, preparatın üzerine bir damla imersiyon yağı
uygulanır.
6. Kondansör, Koehler aydınlatmasına göre ayarlanır ve örnek mikroskop altında
incelenir.
7. Đnceleme tamamlandıktan sonra, kondansör lensi ve objektif lensi temizlenir
Hücre Yaymasının Yapılması (Cell smear)
Protokol 1. Bir damla, hücre veya bakteri süspansiyon solüsyonu, lamın yüzeyine uygulanır.
Hücre lekesi solüsyonu, eğer içinde serum var ise daha iyi yayılır.
2. Lamel, lam üzerinde, hücre solüsyonun eklendiği kısmın üzerine kapatılır ve örneğin
yayılması beklenir.
3. Lamel üzerinden, hafifçe bastırılarak, hücre solüsyonu lam üzerine yavaşça ve hafifçe
yaydırılır.
4. Yaydırılma işleminden sonra, lamel kaldırılır ve yayılan solüsyonun sabitleme ve
boyanma işlemi için kuruması beklenir.
Örneklerin Sabitlenmesi
Birçok boya maddesinin özel sabitleyici kimyasalları mevcuttur. Bu kimyasallardan metanol,
gluteraldehit, paraformadehit hücrelerin ve bakteri solüsyonlarının sabitlenmesi için sıklıkla
kullanılmaktadır.
1. Đncelenmek istenen örneğin yüzeyine metanol uygulanır. Bu işlem için ufak
tablalar ve beher kullanılabilir. Ek olarak, metanol, pipet ile de örneğin üzerine
uygulanabilir. (Metanol, havadaki suyu emeceğinden ötürü, boyama işlemini
engeller)
2. 5 dakika bekletildikten sonra, metanol örnek üzerinden temizlenir.
3. Taze metanol tekrar uygulanır ve 5 dakika bekletilir
4. Hava ile kurumaya bırakılır.
Örneklerin Boyanması
• Hücrelerin boyanması, hücrelerin mikroskop altında kolaylıkla incelenebilmesi için
kontrast sağlamaktadır. Kullanılan boyanın çeşidi, incelemek istediğimiz hücre
örneğine göre ve bilimsel araştırmamıza göre değişmektedir. Çeşitli hücreler için
geliştirilen boyaların yanında, organeller için ve belirli kimyasallara tepki verecek özel
Boyalarda geliştirilmiştir.
• Gram boyama aparatı, bakteri hücrelerinin boyanması için hızlı ve ideal bir yöntemdir.
Bunun yanında Gram boyaları bozulmaya karşı dayanıklıdırlar. Gram boyasının
içindeki, kristal mor boyası (crystal violet stain) maya hücrelerinin boyanması için de
kullanılabilmektedir ancak bu boya kullanıldığı takdirde, maya hücrelerinin morfolojisi korunamamaktadır. Auromine boyası da birçok bakteri hücresini
boyamaktadır ancak Gram boyası gibi bakteri türlerini ayırt etmemizi
sağlamamaktadır.
• Wright boyası ve Giamsa boyası, kan hücrelerini ayırt etmemize olanak sağlar. Ayrıca
bu boyalar, birçok ökaryot hücrelerin boyanmasını da sağlamaktadır ve kullanımları
kolaydır.
• Metilen mavisi, her çeşit hücreyi boyamaktadır ancak hücreler ile ilgili detayları
kaçırma
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder